马伊琍从小在上海弄堂里长大，15岁时参加上海电视台的综艺舞蹈队，马伊琍开始正式自食其力。她那时赚到的演出费不光能付清学校的学费，还有不少的剩余。1993年，马伊琍被选中主演电影《刘海粟》，那是她的第一次触电经历，并得到了高达800块的片酬。1994年，考入上海戏剧学院94级表演系本科。
1996年，与保剑锋等人共同主演其首部电视剧《真空爱情记录》，饰演夏文心，该剧是中国内地首部偶像剧。1998年，马伊琍从上海戏剧学院表演系毕业后，主演了个人首部电影《玻璃是透明的》。1999年，主演电视剧《理想万岁》。2001年，主演电视剧《给我一支烟3：今夜无眠》。2002年9月，主演管虎执导的电影《西施眼》；11月，在电视剧《铁齿铜牙纪晓岚续》中饰演颜如玉。2003年7月，在电视剧《还珠格格第三部：天上人间》中，因饰演夏紫薇一角而被大众所熟知 。9月，在李亚鹏主演的电视剧《谁都会说我爱你》中饰演女二号；10月，主演管虎执导的电视剧《七日》。2005年9月，主演都市情感剧《五妹》。
2006年2月，与陈建斌等人共同主演电视剧《乔家大院》，饰演江雪瑛，并凭借该剧获得第23届中国电视金鹰奖-观众喜爱的女演员奖。4月，与黄磊等人共同主演电视剧《天一生水》；10月，主演古装剧《锦衣卫》。2007年5月，与佟大为等人共同主演青春励志剧《奋斗》，因饰演夏琳一角而获得更多关注，并凭借该剧分别获得2007BQ红人榜-年度艺术红人奖，以及2008-2009风尚权力榜-风尚最受欢迎女演员奖；9月，主演电影《江北好人》，并凭借该片获得了第2届华鼎奖之中国年度影视表现最佳女演员奖等奖项。2008年10月，主演电视剧《美丽无声》；11月，怀孕期间拍摄的电视剧《锁春记》首播。
2010年8月16日，与佟大为等人共同主演的电视剧《婚姻保卫战》首播，马伊琍凭借该剧获得第1届亚洲彩虹奖之最佳女喜剧演员奖；8月18日，主演的电视剧《经纬天地》在央视八套黄金强档首播，该剧是马伊琍产后复出的首部电视剧；10月，主演电视剧《青春期撞上更年期》，并凭借该剧获得优酷影视指数盛典——2011开年盘点之开年优酷指数最佳女演员奖。2011年4月，与范伟等人共同主演电影《跟踪孔令学》，并凭借该片获得第3届英国万像国际华语电影节之优秀女配角奖。7月，与涂松岩共同领衔主演电视剧《双城生活》，并凭借该剧获得了2011国剧盛典-年度最佳女演员奖。
2012年6月，与李晨共同主演电视剧《风和日丽》。2013年3月29日，马伊琍在2012中国电视剧年度明星盛典中获得表演突破奖；9月，与文章共同主演电视剧《小爸爸》，在该剧中马伊琍首次担任制片人，文章则首次担任导演。2015年11月，主演都市情感剧《北上广不相信眼泪》，并凭借该剧获得第19届华鼎奖之中国百强电视剧最佳女主角。2016年9月，与陈建斌共同主演电视剧《中国式关系》，并凭借该剧提名第23届上海电视节白玉兰奖的最佳女主角奖。
2017年3月，与文章共同主演电视剧《剃刀边缘》，7月，主演都市情感剧《我的前半生》，在剧中饰演罗子君，并凭借该剧获得第24届上海电视节白玉兰奖的最佳女主角等奖项。7月27日，出演“建国三部曲”系列影片的第三部《建军大业》。2018年9月3日，与何赛飞等人共同主演电影《那些女人》，并凭借该片获得第21届上海国际电影节-电影频道传媒大奖-最受传媒关注女配角；9月14日，与王学兵共同主演电影《未择之路》，并凭借该片获得第75届威尼斯国际电影节-“聚焦中国”单元焦点女演员奖；10月5日，与姚晨共同主演电影《找到你》，并凭借该片获得第十届中国电影导演协会2018年度奖-年度女演员奖、第25届华鼎奖-中国电影最佳女主角等多个奖项。
2019年5月，与富大龙等人共同主演电影《进京城》，并凭借该片提名第21届上海国际电影节-电影频道传媒大奖-最受传媒关注女主角；9月，与刘烨共同领衔主演的都市创业剧《在远方》播出，并凭借该剧提名第26届上海电视节白玉兰奖-最佳女主角。2020年5月，马伊琍等人领衔主演的电视剧《在不安的世界安静地活》杀青；8月，与高伟光共同领衔主演的民国情感剧《旗袍美探》网台同播，并凭借该剧获得第29届华鼎奖-中国近现代题材电视剧最佳女演员。2021年12月，与徐峥等人共同主演爱情片《爱情神话》，并凭借该片提名第33届华鼎奖-中国电影最佳女主角。2022年4月，与白宇共同领衔主演的电视剧《龙城》杀青；8月，加盟综艺节目《跃上高阶职场》；11月3日，由王家卫执导、马伊琍等人主演的剧集《繁花》正式官宣。
2023年3月3日，网剧《交错的场景》正式官宣由马伊琍等人领衔主演。
2004年，马伊琍被中华骨髓库聘请为爱心大使，在当时抽取了造血干细胞并采集了8ml血样，等待需要的病者配型。2009年09月25日，马伊琍在无锡获得了2009年度“中国国际年度绿色风云人物”。以表彰她积极地参与“保护环境，关爱地球”的公益活动。2010年6月26日，文章和马伊琍共同发起的专注于自闭症儿童援助的“We Can”艺术慈善计划在北京启动。
2011年，马伊琍代言了由邓飞等媒体人发起的“免费午餐”公益项目，旨在为贫困地区的孩子提供营养午餐。2012年10月23日，在电影《三个未婚妈妈》首映礼活动中，马伊琍被聘为南通城市形象宣传大使。2013年2月，马伊琍通过天使妈妈基金平台为需要换肝的儿童向俊宇捐款4万元。
2015年10月22日，马伊琍被联合国儿童基金会（UNICEF）正式委任为中国大使。12月17日，俄罗斯总理德米特里·阿纳托利耶维奇·梅德韦杰夫在俄罗斯驻华大使馆与中国青年代表座谈。黄晓明、马伊琍、许晴作为中国电影界代表出席活动，并受到俄罗斯总理接见。
2016年9月，由《南方人物周刊》杂志主办的第十二届中国青年领袖致敬盛典在北京举行，马伊琍获得“2016中国青年领袖”奖。2018年1月31日，《中国慈善家》揭晓了“2017中国慈善名人榜”，马伊琍排名第22。2019年6月，担任第25届上海电视节白玉兰奖的评委。2021年7月，马伊琍向河南暴雨灾区捐款50万元。
在马伊琍清晰的发音之间，夹杂着上海人讲普通话时独有的节奏感；她的笑声很爽朗，可咧嘴的角度还是含蓄地有所保留，她的皮肤算不上白皙，像玫瑰赤豆糕外面包的糯米纸，细腻而透明。举手投足，还是个上海囡囡，有风情没架子，有小缺点，却更亲切。在影视圈这样一个荣誉和金钱来得太快的地方，人们容易忘了自己本来的样子，可马伊琍却像戴着真空面罩，因为不受诱惑，所以活得自在，踏踏实实花自己辛苦工作赚来的钱，如常人一般过着属于自己的日子。马伊琍最让人无法忽视的地方是她的睫毛，纤长微卷，呈扇型散开。当她认真时，睫毛如一层雾水，半遮盖在眼睛上，只流露出坚定的眼神，即使猜不透她心里到底在想什么，也必然会了解这个女人骨子里不容置疑的刚性，让人不敢轻视她，不敢亵渎她。这样的女人，被她吸引是必然。
马伊琍是个可塑性很高的女演员。一部《还珠格格3》让大家看到了一个不同以往的“夏紫薇”，她没有再接再厉成为又一个琼瑶女郎；转而在《奋斗》中大展自己的真性情，坚强、独立、敢爱敢恨，笑起来的样子最感染人；她不是夏琳，更不是80后女生代言人，她又成了《婚姻保卫战》里的李梅，一个自信满满的大女人。到2011年的《双城生活》，观众们发现，生长于上海的马伊琍，也可以刻画一个地道的北京女孩。在生活中，婚姻和孩子让她变得更柔和、更宽容，她的美，亲切随和，如一阵微风，触手可及，带给人温暖。
马伊琍在多重都市女性角色的转换中，成为了一个演技日臻成熟的女演员，戏里的成功也让马伊琍现身年末各大时尚典礼现场，取得多个时尚先锋类大奖，成为时尚界的宠儿，性感、可爱、高贵、神秘，多变的造型也得到业界的普遍肯定。
